YIJI 活體組織氧化應(yīng)激活性氧（ROS）高質(zhì)熒光測(cè)定試劑盒產(chǎn)品說明書（中文版）

主要用途

YIJI 活體組織氧化應(yīng)激活性氧（ROS）高質(zhì)熒光測(cè)定試劑是一種旨在通過透膜熒光染色劑氯甲基二氯

二氫熒光素二乙酯，在組織氧化損傷條件下，產(chǎn)生熒光，來定量檢測(cè)組織內(nèi)活性氧族的生成和增加的

而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)由大師級(jí)科學(xué)家精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。適宜于活體動(dòng)物組織的分析。可

以被用于細(xì)胞凋亡、信號(hào)傳遞、衰老、代謝和營養(yǎng)學(xué)等的研究。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡(jiǎn)易，活

體檢測(cè)，性能穩(wěn)定。

技術(shù)背景

超氧自由基陰離子（superoxide radical；O2-）、過氧化氫（hydrogen peroxide；H2O2）、羥自由基或氫氧基

（hydroxyl radical；OH-）、過氧化基（peroxyl radical；ROO-）、氫過氧自由基（hydroperoxyl；HOO）、烷

氧自由基（alcoxyl radical）、氮氧基（nitric Oxide；NO-）、過氧亞硝基陰離子（peroxynitrite anion；ONOO-）

次氯酸（hypochlorous acid；HOCl）、半醌自由基（semiquinone radical）、單線態(tài)氧氣（singlet oxygen）等

細(xì)胞內(nèi)活性氧族（Reactive Oxygen Species；ROS）的產(chǎn)生和增多，將導(dǎo)致細(xì)胞衰老或凋亡。氯甲基二氯二

氫熒光素二乙酯（6-chloromethyl-2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate, acetyl ester；CM－H2DCFDA）是

取代二氯二氫熒光素二乙酯（2´,7´-dichlorodihydrofluorescin diacetate；DCFH-DA）的升級(jí)產(chǎn)品，一種*

自由通過細(xì)胞膜，并在細(xì)胞內(nèi)長(zhǎng)期滯留而不易外漏的染色劑。一旦被過氧化氫、羥自由基或氫氧基、過氧

化基、次氯酸等氧化，便產(chǎn)生熒光。據(jù)此測(cè)定組織細(xì)胞內(nèi)活性氧族的濃度。

產(chǎn)品內(nèi)容

YIJI 清理液（Reagent A）

YIJI 染色液（Reagent B）

YIJI 稀釋液（Reagent C）

產(chǎn)品說明書

毫升

微升

毫升

1份

保存方式

保存 YIJI 染色液（Reagent B）在－20℃冰箱里，嚴(yán)格避免光照；其余的保存在 4℃冰箱里，有效保

證6月

用戶自備

50 毫升錐形離心管：用于組織收集的容器

15 毫升錐形離心管：用于工作液配制和組織處理的容器

1.5 毫升離心管：用于工作液配制的容器

6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板：用于組織染色的容器

培養(yǎng)箱或恒溫水槽：用于染色孵育

熒光顯微鏡：用于觀察熒光組織

熒光分光光度儀：用于組織熒光定量檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)步驟

方法一：新鮮組織薄片定性檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的 YIJI 染色液（Reagent B）置入冰槽里融化，YIJI

稀釋液（Reagent C）放進(jìn) 37℃恒溫水槽里預(yù)熱。然后移出 xx 微升 YIJI 染色液（Reagent B）到新

的 15 毫升錐形離心管，加入 xx 毫升 YIJI 稀釋液（Reagent C)，混勻后，將 YIJI 染色工作液

置入暗室里。然后進(jìn)行下列操作。

1． 手術(shù)取出動(dòng)物組織

2． 放進(jìn)預(yù)冷的 50 毫升錐形離心管

3． 加入 xx 毫升 YIJI 清理液（Reagent A）浸泡 15 秒

4． 用鑷子取出組織，用無菌綿紙吸干

5． 即刻用刀片切離組織為 1cm X 1cm 大小的片狀組織

6． 用鑷子將組織薄片放進(jìn) 6 孔培養(yǎng)板的一個(gè)孔

7． 加 xx 毫升含有 YIJI 染色液（Reagent B）和 YIJI 稀釋液（Reagent C）的 YIJI 染色

工作液

8． 放進(jìn) 37℃培養(yǎng)箱孵育 20 分鐘，避免光照（注意：如果組織薄片較厚，可以增加孵育時(shí)間至 60 分鐘）

9． 小心抽去 YIJI 染色工作液

10．加入 xx 毫升 YIJI 清理液（Reagent A）

11．用鑷子將組織薄片放在載玻片上

12．壓片

13．即刻在熒光顯微鏡下觀察（定性檢測(cè)）：激發(fā)波長(zhǎng) 490nm，散發(fā)波長(zhǎng) 520nm――熒光增強(qiáng)，表明活性氧

族（ROS）含量高

方法二：組織勻漿定量檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的 YIJI 染色液（Reagent B）置入冰槽里融化，YIJI

稀釋液（Reagent C）放進(jìn) 37℃恒溫水槽里預(yù)熱。然后移出 xx 微升 YIJI 染色液（Reagent B）到新

的 1.5 毫升離心管，加入 xx 微升YIJI 稀釋液（Reagent C)，混勻后，將 YIJI 染色工作液置入

暗室里。然后進(jìn)行下列操作。

1． 手術(shù)取出動(dòng)物組織，并秤重以確定組織重量 100 毫克

2． 放進(jìn)預(yù)冷的 50 毫升錐形離心管

3． 加 xx 毫升的 YIJI 清理液（Reagent A）

4． 用鑷子取出組織，用無菌綿紙吸干

5． 即刻用刀片切碎組織

6． 放進(jìn)一個(gè)預(yù)冷的 15 毫升錐形離心管

7． 加入 xx 毫升預(yù)冷的 YIJI 稀釋液（Reagent C）

8． 渦旋震蕩 5 秒，充分混勻

9． 即刻放入預(yù)冷的 YIJI 勻漿器

10．在冰槽里用研磨棒勻化組織（注意：切莫過度勻化）

11．將所有組織勻漿物移入 15 毫升錐形離心管

12．置入冰槽里備用

13．移取 5 微升組織勻漿物進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)：建議使用 YIJI Bradford 蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒

（GMS30030.1）

14．移取 xx 微升組織勻漿物（樣品：100 微克蛋白）或 xx 微升 YIJI 稀釋液（Reagent C）（背景對(duì)

照）到 1 毫升比色杯里

15．加入 xx 微升升含有 YIJI 染色液（Reagent B）和 YIJI 稀釋液（Reagent C）的 YIJI

染色工作液

16．上下傾倒混勻

17．放進(jìn) 37℃恒溫水槽孵育 20 分鐘，避免光照

18．即刻放進(jìn)熒光分光光度儀檢測(cè)：激發(fā)波長(zhǎng) 490nm，散發(fā)波長(zhǎng) 520nm——（樣品 RFU-對(duì)照 RFU）＝實(shí)

際 RFU：增加，表明活性氧族（ROS）含量高

注意事項(xiàng)

1． 本產(chǎn)品為 20 次（組織勻漿）或 8 次（組織薄片）操作，包括背景對(duì)照

2． 建議使用新鮮組織，手術(shù)切除后 1 小時(shí)內(nèi)的樣品

3． 操作時(shí)，須戴手套

4． 系統(tǒng)檢測(cè)，背景對(duì)照只需 1 次

5． YIJI 染色工作液配制后 1 小時(shí)內(nèi)使用為佳

6． 孵育時(shí)，須避免光照

7． 如果組織薄片較厚，可以增加孵育時(shí)間至 60 分鐘

8． 組織勻漿時(shí)，切莫過度

9． 建議組織染色完成后，即刻進(jìn)行熒光定量或定性分析

10．本公司提供陽性對(duì)照甲萘醌溶液，觀察組織熒光增強(qiáng)現(xiàn)象

11．本公司提供系列活性氧檢測(cè)試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

1． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定

2． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定熒光清晰